首批EF65-1000型機車投入使用，用於取代東北本線使用的EF65-500型機車。
這些機車原本沒有頂棚，後來才在車窗上方加裝了頂棚，但車頭燈上方沒有，這使得它們的外觀與1018號之後的同系列機車有所不同。
1001號機車是該系列中最後一輛保留日本國鐵塗裝的機車，一直服役到2008年，目前存放於東京貨運站。
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